农药登记毒理学试验方法(毒理学体外试验方法常用)

本报告由农驰宝大数据独家原创

在一期的内容中，我们讨论了农药的急性毒性实验的相关概念、标准与要求。

在国际农药登记中，毒性试验的评估并不仅限于急性毒性实验，而是会根据产品评估的情况不同，对各方面的毒性情况进行总和评估，本文拟对农药登记中目前企业常见的各类毒理学评估领域做简要介绍

1短期毒性

短期毒性试验还为慢性毒性试验提供试验设计依据。短期毒性试验数据应该能够获得如下试验结果：

（1）剂量与不利影响之间的关系；

（2）有效成分的毒性数据，包括NOAEL；

（3）靶标器官（有关的话）；

（4）中毒的时间进程和特征，详细的行为改变和病理学尸检结果；

（5）产生的特殊毒害作用和病理学改变；

（6）经过不间断给药后，所观察到的某些毒害作用的持续时间及可恢复性；

（7）可能的话还可观察到毒作用方式；

（8）不同接触途径的相对毒害程度。

2亚慢性和慢性毒性试验

2.1.亚慢性毒性试验

确定一定时期内经口、经皮或经呼吸道反复接触受试化学物引起的毒性效应，了解毒作用靶器官、损害程度和无作用浓度水平，为确定相应的慢性毒性试验的浓度提供依据。

亚慢性毒性试验是指实验动物在其部分生存期（不超过10%寿命期）内，每日反复经口、经皮或吸入接触受试样品后所引起的健康损害效应。要求获得如下信息：（1）无可见有害作用水平（NoObservedAdverseEffectLevel，NOAEL）：在规定的试验条件下，用现有的技术手段或检测指标未观察到任何与受试样品有关的毒性作用的最大染毒剂量；（2）最低可见有害作用水平（LowestObservedAdverseEffectLevel，LOAEL）：在规定的试验条件下，受试样品引起实验动物形态、功能、生长发育等发生有害改变的最低染毒剂量；（3）靶器官(TargetOrgan)：实验动物出现由受试样品引起的明显毒性作用的任何器官。

各组实验动物每日经皮、经口或吸入不同剂量的受试样品，连续染毒3个月（90d），有时候可根据需要染毒6个月（180d），染毒期间每日观察动物的毒性反应。在染毒期间死亡的动物要进行尸检。染毒结束后所有存活的动物均要处死、剖验以及作适当的病理组织学检查。

以急性经口亚慢性毒性试验为例，试验报告的内容应包括：

（1）试验方法；

（2）按性别和剂量的毒性反应数据；

（3）试验期内动物死亡的数量和时间；

（4）毒性作用或其它作用；

（5）每种异常症状出现的时间及其转归情况；

（6）动物体重资料、食物摄入量和/或饮水量资料；

（7）眼科检查结果；

（8）血液学检查结果；

（9）临床生化检查结果；

（10）大体解剖所见；

（11）病理组织学检查所见的详细描述；

（12）对结果进行处理的统计学方法；

（13）确定无可见有害作用水平（NOAEL）；

（14）。

2.2.慢性毒性试验

实验动物呼吸道反复吸入不同浓度的受试样品，观察实验动物的毒性效应、严重程度、靶器官和损害的可逆性，确定无作用浓度，为制定人类接触该受试样品的工作场所职业接触限值（OEL）和每日容许摄入量（ADI）提供依据。

慢性吸入毒性(ChronicInhalationTocxicity)：动物在正常生命期的大部分时间内经呼吸道、经皮或经口接触受试样品所引起的健康损害效应。试验需要获得如下信息：

（1）无可见有害作用水平（NoObservedAdverseEffectLevel，NOAEL）：在规定的试验条件下，用现有的技术手段或检测指标未观察到任何与受试样品有关的毒性作用的最大染毒浓度。可用动物每日接触单位体积空气受试样品的质量（mg/m3）表示；

（2）最低可见有害作用水平（LowestObservedAdverseEffectLevel，LOAEL）：在规定的试验条件下，受试样品引起实验动物形态、功能、生长发育等发生有害改变的最低染毒浓度。可用动物每日接触单位体积空气受试样品的质量（mg/m3）表示；

（3）靶器官(TargetOrgan)：实验动物出现由受试样品引起的明显毒性作用的任何器官。

慢性毒性试验，动物染毒周期为连续染毒1年以上，小鼠通常为一年半，大鼠通常为两年。

以慢性经口毒性试验为例，需要观察的指标有：

（1）临床观察；

（2）血常规检查和其它血液指标检查

（3）尿液检查

（4）临床生化检查

（5）病理检查

病理检查，包括肉眼大体检查和镜检是慢性毒性试验的重要部分。应全面检查、详细描述和记录。一般包含肉眼剖检与组织病理检查两部分。

慢性毒性试验结果应结合前期试验结果，并考虑到毒性效应指标和解剖及病理组织学检查结果进行综合评价。毒性评价应包括受试样品染毒剂量与是否出现毒性反应、毒性反应的发生率及其程度之间的关系。这些反应包括行为或临床异常、肉眼可见的损伤、靶器官、体重变化情况、死亡效应以及其它一般或特殊的毒性作用。成功的慢性试验应能够提出统计学上有意义的无作用水平（NOAEL）。

试验结束后的鉴定报告：鉴定报告包含的内容参见亚慢性试验，而且还必须包括以下内容：

（1）该试验在何实验室完成，实验室的名称和地址；

（2）试验日期；

（3）试验和报告负责人。

鉴定报告还必须包括所有必要的信息，对试验过程和结果评价提供全面而准确的描述。必须包括摘要、资料分析和等，摘要必须对试验资料以及任何与对照组比较有异常的数据进行概括。

试验结果的解释：慢性经口性试验能够提供受试样品在长期接触该受试样品时的毒性作用资料，为拟定人类接触该化学物的职业接触限值（OEL）和每日容许摄入量（ADI）提供依据。但由于本试验并不主要研究受试样品致癌性，确定受试样品致癌性仍有限。

3遗传毒性试验（genotoxicitytest）

遗传毒理学（genetictoxicology）是毒理学的一个分支，它研究化学物质或其它环境因素对有机体细胞遗传物质的损伤，以及对机体的遗传学改变，阐明遗传毒性对机体健康的作用后果及作用机制。研究农药的遗传毒性目的就是阐明农药对人及生物体遗传物质潜在的危害作用，建立预警机制，采取干预措施，确保人类健康和生物安全及生态平衡。

一般而言，化学物质或环境因素对生物体的遗传毒性主要表现为如下几类：基因突变、染色体畸变和染色体数目异常（表1）。

表1：遗传毒性的类型

基因突变

染色体畸变

染色体数目异常

基因结构改变

碱基对互换

移码突变或移码框突变

三核苷酸重复

大段损伤

染色体或染色单体断裂，造成染色体或染色单体缺失，或引起各种重排，从而出现染色体结构异常，成为染色体畸变或染色体结构畸变。

染色体数目异常或染色体数目畸变，也称基因组突变。染色体数目可以出现倍体改变和非整数倍体改变。整数倍体改变可以有二倍体、三倍体或四倍体。

遗传信息改变

同义突变

错义突变

无义突变

基因突变方向

正向突变

化学品或环境因素造成遗传毒性的机制主要有：DNA损伤、DNA修复与突变、整倍体和非整倍体的形成等。

遗传毒性造成的后果有多种。体细胞突变的后果有肿瘤、老化和致畸等，生殖细胞突变的后果可以是致死的（显性致死如流产、死产）、也可以是非致死的（出生缺陷和先天性疾病）。

遗传毒理学试验可以作为生殖细胞诱变剂、体细胞诱变剂及潜在致癌物的鉴定。遗传毒理学试验一般采用组合材料方式，如利用病毒、细菌、真菌、培养的哺乳动物细胞、植物、昆虫和哺乳动物等。OECD建议的化学品遗传毒理学试验主要有：果蝇伴性隐性致死试验（Sex-linkedRecessiveLethalTestinDrosophilamelanogaster），啮齿类显性致死试验（Rodentdominantlethaltest），哺乳动物细胞姐妹染色单体互换体外试验（InvitroSisterChromatidExchangeAssayinMammalianCells），酵母菌基因突变试验（SaccharomycescerevisiaeGeneMutationAssay），酵母菌线粒体重组试验（Saccharomycescerevisiaemioticrecombinationassay）,DNA损伤与修复体外哺乳动物细胞程序外DNA合成(DNADamageandRepair/UnscheduledDNASynthesisinMammalianCellsinvitro),小鼠斑点试验（MouseSpotTest），小鼠可遗传易位试验（MouseHeritableTranslocationAssay）等。

目前已经发表过的，涉及遗传毒理学试验的材料和方法有很多种，这里引用卡萨瑞特、道尔毒理学第六版列出的遗传毒理学试验清单中的主要内容（表2），便于读者更好地理解遗传毒理学的内容方法。这些方法中只有很少一部分被农药管理管理所采用。

表2：遗传毒理学试验材料和方法

I．DNA损伤和修复试验

II．原核基因突变试验

III．非哺乳类真核细胞试验

DNA损伤的直接检测（三种方法）；检测DNA损伤的细菌试验（两种）；哺乳动物细胞可修复DNA损伤试验（两种）

检测基因突变的真菌试验（两种）；检测非整倍体的真菌试验（两种）；检测诱发重组的真菌试验（一种）；植物试验（四种）；果蝇试验（四种）

IV．哺乳动物基因突变试验

V．哺乳动物细胞遗传试验

VI．生殖细胞致突变试验

体外正向突变试验（三种）；检测体细胞基因突变的体内试验（两种）；转基因试验（三种）

染色体畸变（两种）；微核（三种）；姐妹染色单体交换（两种）；丝裂细胞非整倍体（六种）

DNA损伤的测定（三种）；基因突变（三种）；染色体畸变（三种）；显性致死试验（一种）；非整倍体（三种）

遗传毒性的试验目的是预测遗传毒性、早期确定遗传毒性致癌物，解释某些致癌物的作用机制。

为了避免试验体系造成的假象，在致突变作用的在体（invivo）或体外（invitro）试验中都不能设置额外的毒作用剂量。

还要求体细胞在体试验：包括为哺乳动物细胞微核试验（Directive92/69/EECmethodB12），小鼠斑点试验（Directive87/302/EEC,PartB）和哺乳动物骨髓细胞染色体畸变(Directive92/69/EECmethodB11)。

如果所有体外试验的结果都是阴性的，则需要考虑到其他可获得的信息（如毒动力学(Toxicokinetics)、毒物效应动力学(Toxicodynamics)和理化性质资料以及类似物的资料）进行进一步的试验。要用不同于已经使用的代谢体系进行在体或体外试验。

如果体外细胞遗传试验结果是阳性的，则必须进行体细胞（somaticcells）在体试验[啮齿动物骨髓中期分析试验(metaphaseanalysisinrodentbonemarrow)或啮齿动物微核试验（micronucleustest）]。

如果体外基因突变试验的任何一种是阳性结果，还必须进行在体试验，即程序外DNA合成试验（unscheduledDNAsynthesis）或小鼠斑点试验（mousespottest）。

根据情况还可能要求在体精细胞（germcells）试验：任何一项在体试验出现阳性结果的，就可能需要进行在体精细胞试验。是否需要进行这些试验还要考虑到毒动力学、使用和预期接触等信息。合适的试验可能包括观察与DNA的相互作用（即显性致死测定）、可能的遗传（inherited）效应（甚至定量遗传效应）。

4长期毒性试验和致癌性试验

欧盟对所有原药登记都要求长期毒性试验（也可以称为慢性毒性试验）和致癌试验。这些试验的目的是：

（1）确定长期接触原药造成的毒害作用；

（2）确定毒作用器官（有关的话）；

（3）确定剂量-反应关系；

（4）确定毒作用症状的变化和可观察到的表现；

（5）确定NOAEL。

同样，致癌试验的目的是：

（1）确定接触原药可能造成的致癌作用；

（2）确定导致肿瘤的动物种和靶器官特异性；

（3）确定剂量-反应关系；

（4）对非遗传毒性的致癌物，确定不引发有害作用（adverseeffect）的最大剂量（阈剂量）。

欧盟要求的试验方法为：Directive87/302/EEC,PartB，即慢性毒性试验、致癌试验或者慢性/致癌联合试验。

5生殖毒性和发育毒性

生殖毒性是指农药对生殖系统及其生殖功能的影响，就是对雌性和雄性动物生殖系统的结构和功能的影响，包括对排卵、精子发生、生殖细胞分化、胚胎发育的影响以及对生殖能力甚至队后代的不良影响等。

发育毒性则泛指有害物质对胚胎发育过程的损害，还可以用胚胎-胎儿毒性（embryo-fetaltoxicity）来表述。农药对胚胎发育的影响涵从卵子受精到整个胚胎的形态结构和功能发育完成的整个过程。

农药对生殖的不利影响主要有两个方面：削弱男性或女性的生育能力和影响后代的正常发育（发育毒性）。根据欧盟原药登记要求，原药对雌性或雄性供试动物的生殖生理的影响、对后代出生前和出生后发育的影响都需要进行研究和报告。如果提出免做这方面的研究，则必须说明充足的理由。

生殖毒性试验一般有两种：多代试验（multi-generationstudies）和发育毒性试验。

多代试验的目的是提供充足的信息来说明如下问题：

（1）确定供试原药对生殖的直接和间接影响；

（2）确定对一般毒性（在短期和慢性试验中发现的）是否有加强作用；

（3）确定剂量-反应关系，确定毒害症状（toxicsign）和表现（manifestation）的变化；

（4）确定NOAEL。

大鼠试验至少需要经过两代。生殖器官的重要也需要报告出来。为了进一步解释生殖试验的结果，又是可能需要进行一些补充试验，以便提供更多信息：

（1）雌性和雄性的单独研究；

（2）三段设计；

（3）雄性生育力显性致死测定；

（4）被处理雄性与未处理雌性的交配，以及被处理雌性与未处理雄性的交配；

（5）对产精能力（spermatogenicity）的影响；

（6）对卵子发生(oogenesis)的影响；

（7）对精子运动性（motility）、迁移率（mobility）及形态的影响；

（8）激素作用。

欧盟建议采用的方法是：Directive87/302/EEC,PartB。

发育毒性试验的目的是：

（1）确定接触原药对胚胎（embryonic）和胎儿（foetal）发育的直接或间接影响；

（2）确定可能的母体毒性（maternaltoxicity）；

（3）建立母亲和后代可观察到的剂量-反应关系；

（4）确定毒害症状（toxicsign）和表现（manifestation）的变化；

（5）确定NOAEL。

欧盟建议采用的方法是：Directive87/302/EEC,PartB。

6神经毒性和迟发性神经毒性

农药的神经毒性是指农药引起生物体内神经系统结构和功能损害的作用。农药中的杀虫剂，主要是神经毒剂。有机氯杀虫剂、有机磷杀虫剂、氨基甲酸酯类杀虫剂、拟除虫菊酯类杀虫剂都是神经毒剂，他们对昆虫和对人的作用基本一致。阿维菌素对昆虫是神经毒剂，对哺乳动物也是神经毒剂。

农药神经毒剂产生的神经毒害作用主要有：神经元病、轴突病、髓鞘病、神经传递受损、影响神经系统信号转导、发育神经毒性等。

实践发现有机磷酸酯杀虫剂的某些品种还能引起迟发性神经毒性（Delayedneurotoxicity）。由此引起的神经系统疾病被称为有机磷迟发性神经病（organophosphateinduceddelayedneuropathy,OPIDN）。所谓迟发性神经毒性是指中毒症状发生后8~14天，甚至3~5周再出现的较持久的神经症状。通常先累及感觉神经，之后出现运动神经症状。一般多见于下肢远端部分，然后发展至上肢，并向肢体近端延伸。主要症状有肢体麻木、疼痛、肢体无力、共济失调，重症患者可出现肢体远端肌肉萎缩。

最早于1930年就证明有机磷化合物三邻甲苯磷酸酯（TOPC）可引发迟发性神经毒性，但是它不被用作农药。20世纪50年代陆续发现有机磷酸酯杀虫剂引起迟发性神经毒性的案例，引起的病变与TOPC类似。丙胺氟磷、丙氯磷、对溴磷、三硫磷、苯硫磷、脱叶磷、敌百虫、敌敌畏、甲胺磷等有引发迟发性神经毒性的作用。迟发性神经毒性的机理尚不清楚。

发育神经毒性（developmentalneurotoxicity）也是农药登记需要提供的神经毒性资料。发育神经毒性是指出生前经由父体和（或）母体接触外来理化因素引起的在子代到达成体之前神经系统出现的有害作用。正常胚胎、胎儿和新生儿期神经细胞的增殖、迁移、分化、髓鞘形成和突触形成等都按其固有程序进行，某些农药可以作用于某些相关区域或过程而导致神经发育异常，表现为器官发育错误、神经管不正常发育及脑某一部分不正常发育的结构异常；细胞成分组织混乱，不正常营养对细胞分裂、髓鞘形成及神经原形成的影响；代谢错误引起的有毒物质堆积，导致不可逆的精神异常等。

农药登记要求的神经毒性测试项目：欧盟农药登记资料仅要求提供原药迟发性神经毒性研究报告。美国视不同情况要求90-天大鼠神经毒性和28-天（原来要求90天，后建议改为28天）母鸡神经毒性试验报告，以及发育神经毒性试验报告等。中国农药登记（新原药）对有机磷酸酯农药以及化学结构与引起迟发性神经毒性作用的阳性物质相似的其他农药，要求迟发性神经毒性试验报告。

对该项试验，欧盟建议采用OECDmethod418进行。

7其他毒理学研究

对有些产品而言，可能需要对其有毒杂质进行毒理学研究。这不是常规要求项目。

某些情况下还需要做如下一些研究：

l吸收、分布、排泄和代谢研究；

l神经毒性研究；

l免疫毒性研究；

其他染毒途径毒性研究等。